结膜干细胞属于单能干细胞,只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化, 即结膜上皮细胞和杯状细胞。目前, 对于结膜干细胞存在部位有几种不同的观点,认为结膜干细胞可能位于穹隆部、皮肤结膜交界处、弥散分布于穹隆部和睑球结膜以及位于睑结膜。一般认为, 具有干细胞的部位,细胞增殖能力较强\生长快。因此,我院于2004年7月起尝试体外分离培养人眼结膜上皮细胞, 通过观察其生长特性, 来明确结膜干细胞的存在部位。现将结果报告如下。

　材料与方法

　一、实验材料

　健康成年人猝死拟摘除眼球作角膜移植用的尸眼, 取其穹隆部结膜、睑结膜、角巩缘处球结膜, 显微镜下仔细剔除结膜下组织, 致半透明的薄层结膜上皮, 浸泡在双抗液中浸泡3 m in后, 用D-H anks液洗 3次, 每次1 m in。

　二、实验试剂的制备

　1. 25mg干粉胰岛素加入1m l F12 + DMEM ( 1:1)培养液, 充分混匀, 分装每支200 ????,l - 20 ???? 保存。

　2. 100 ????g表皮生长因子( EGF)加入1m lF12+DMEM ( 1: 1)培养液, 充分混匀, 分装每支200 ????,l -20 ???? 保存。

　3. 备用培养液: 100 m l F12 培养液, 100 m lDMEM培养液, 20m l胎牛血清, 双抗2 m l混匀。

　4. 应用培养液: 100m l备用培养液、EGF 10 ????l、胰岛素20 ????l混匀。

　5. 双抗液制备: 双抗( 10000u 青霉素G 加10000 ????g链霉素) 1m l加入D-H anks液49m l混匀。

　三、方法

　将处理过的结膜上皮组织剪成1mm ???? 1mm大小的上皮碎片, 将其直接贴在培养皿中, 然后将培养皿置培养箱, 半小时后加入培养液, 48 h后换液, 以后每周换液3次, 每天用倒置显微镜观察细胞生长情况。