应用气液界面（Air Liquid Interface, ALI）培养法配合适当的培养基,如PneumaCult?-ALI（Catalog  #05001）可成功实现人原代支气管上皮细胞（HBECs）向具有生理性相关表型细胞的分化。以下内容我们会列出使用PneumaCult?-ALI获得完全分化的假复层黏膜纤毛上皮细胞所需要注意的关键点。

    在铺入细胞培养小室前，细胞先在培养瓶中以浸没式培养：

    起始细胞要选择活性较好的细胞。已传代3代以上的细胞适合ALI培养，但分化成纤毛细胞和粘液分泌细胞则从第4代就减弱了。

    当细胞以浸没式培养汇合接近80%，将原先的培养基更换为PneumaCult?-ALI诱导培养基并孵育过夜（诱导阶段）。请注意，如果细胞在更换PneumaCult?-ALI诱导培养基孵育过程之前已100%汇合超过24小时，可能会对细胞的分化潜能产生负面影响。

    将细胞铺入培养小室前，HBECs必需在PneumaCult?-ALI诱导培养基中过夜培养。

    为确保细胞贴壁，在接种细胞前，培养小室必需用胶原蛋白I包被。使用0.03 mg/mL的胶原蛋白溶液，37°C孵育过夜。任何时候都不要让包被小室的胶原蛋白溶液变干。

    我们推荐使用胶原蛋白溶液Collagen Solution (Catalog  #04902)，包被小室前需将其稀释到推荐的最终浓度。若使用其他厂商的胶原蛋白溶液，请按照该产品说明准备。

    在HBECs汇合后，将培养基更换为PneumaCult?-ALI 扩增培养基，继续培养 。HBECs细胞应覆盖细胞培养小室的全部面积，包括小室边缘。请注意，一些供体细胞群在扩增阶段需要较长的扩增时间达到细胞的汇合。细胞培养保持汇合状态最多可达3天。

    我们推荐使用微孔直径为0.4微米的透明PET小室（如BD Biosciences Catalog #353180)。这种透明的细胞培养小室便于观察所培养细胞的分化迹象。由于一些细胞培养小室可能不支持细胞的粘附或完全分化，因此培养小室的选择非常重要。