信号

　　优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是争论的焦点。第一代CAR介导的T细胞激活是通过CD3z链或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3z链能够提供T细胞激活、裂解靶细胞、调节IL-2分泌以及体内发挥抗肿瘤活性所需的信号1。根据文献报道，第一代CAR改造T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制，氮气抗肿瘤潜力已被临床前实验证实。只有“信号1”的T细胞反应无能，细胞因子分泌减少，增殖减少最终导致改造T细胞的凋亡。肿瘤细胞的清除还需要肿瘤细胞表面表达的共刺激信号。

　　为了加强CAR激活信号并突破第一代CAR的限制，结合了共刺激结构的第二代CAR发展起来了。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。基于目前的T细胞激活模型，CD28提供了T细胞激活的第二刺激信号(信号2)，使源自TCR/CD3复合体的“信号1”扩大。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌。为模拟这种T细胞的激活过程，第二代的CAR设计中同时包括了CD3z链的“信号1”和CD28的“信号2”。许多研究都表明，搭载了“信号2”的第二代CAR与第一代CAR相比，抗原特异性不变，T细胞增殖、细胞因子分泌增加，抗细胞凋亡蛋白分泌增加，细胞死亡延迟。不仅如此，CAR中的CD28还能够使改造后的T细胞抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响。

　　使用不同的共刺激分子使得第二代CAR得到不断发展。将CD3z信号与其他B7家族成员或肿瘤坏死因子受体家族成员成员结合设计CAR的研究已有报道。之后有研究将CD28用CD137(4-1BB)进行替换。使用CD28还是4-1BB，不同的第二代CAR究竟孰优孰劣，不同的研究者用不同的肿瘤在体内和体外的研究中得到的结果不尽相同。

　　除了CD28和4-1BB之外，使用一种NK细胞受体CD244的思路也被提出来。与第一代CAR相比，这种设计能够增加对肿瘤细胞裂解的记忆效应以及CAR介导的杀伤效应。第二代CAR的三种不同设计之间的比较尚未实施。

　　为了进一步改良CAR的设计，许多研究组开始着眼于发展第三代CAR，不仅包括“信号1”、“信号2”，还包括了额外的共刺激信号。不同研究者们用不同材料开展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比较结果是矛盾的。第二代和第三代CAR之间的直接比较尚未开展，故二者之间哪种设计更胜一筹尚无定论。然而目前第二代和第三代的设计都各自已有临床试验的应用，后续如何仍需持续关注。

　　迁移

　　基因改造的肿瘤细胞靶向T细胞必须迁移至相应位点以根除疾病。CAR-T细胞能够迁移到肿瘤周围这一点已经被实验多次证实，新近的临床试验为这一点提供了更有力的证据：基因改造后的T细胞能够表达次生CAR，从而定位于发病部位。来自不同研究者的结果都表明，将CAR改造的T细胞注入病人体内，CAR能够迁移到不同的组织发挥作用。虽然CAR-T的迁移能力已经得到了实验验证，然而我们仍然不清楚T细胞的基因改造和体外扩增是否会对其迁移所必须的趋化因子或细胞因子造成影响。其中一个促进T细胞迁移的策略，是从改造基因以表达细胞因子受体入手。许多研究已经通过在CAR-T细胞中表达CXCR2(CXCL1受体)和CCR4(CCL17受体)来实行这一原则。除却这一策略，找到是T细胞迁移到肿瘤位点的其他方法对于成功消除肿瘤来讲至关重要。

　　存续

　　为了成功消除肿瘤，靶向性的T细胞必须能够在体内存在足够长的时间。利用肿瘤淋巴细胞进行的细胞免疫研究发现，过继的T细胞的持续存在时间与临床疗效之间正相关。调节化疗可以通过多种途径延长过继T细胞的存在时间。最初接受CD19靶向性T细胞治疗的病人没有联合调节性化疗，这使得后续T细胞在体内的存在变得几乎无法检测。而之后的病人接受了联合调解性化疗的治疗，过继免疫6周后仍然能在病人的骨髓中找到基因改造的T细胞。