1、采集：用18号穿刺针穿刺，20ml注射器（内含肝素2000u）在髂前上棘抽取骨髓10ml。抽取骨髓时注意保持针头斜面在骨髓内。迅速抽取骨髓并使其和肝素均匀，防止产生血凝块。

　　2、分离纯化：经1200rpm离心10min，吸除上层脂肪组织，洗涤三次。在骨髓中注入密度为1.073Percoll分离液。室温下3000g离心30min，有核细胞在分界面及上层液体中，红细胞大部分在沉淀中。用两倍体积的PBS稀释，并再次离心。将细胞重悬于低糖10%DMEM+FBS培养液中。调整细胞密度为1.6*106个/cm2接种于培养瓶中。37℃，体积分数为5%的CO2恒温培养箱中培养，72d后弃去未贴壁细胞，以后每3天换液一次。当细胞汇合90%单层细胞后，0.25%胰蛋白酶室温消化传代，离心（1000rpm，10min），弃上清，沉淀按1：1比例传代。

　　3、保存：收集生长良好的细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。将细胞加入到含10%DMSO和30%血清的新鲜培养基中，用无菌塑料冷冻保存管放入到程序降温盒中，于-70℃经24h后转入液氮保存。30d后，复苏细胞，用椎虫蓝染色检测细胞活性，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每日倒置光学显微镜下观察细胞生长情况（细胞生长状态及数量）。主要观察指标：1）人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析；2）细胞冷冻机复苏生长特性分析。