支架材料作为骨组织工程的要素之一,与种子细胞共同构成组织工程的核心—三维空间复合体. 支架材料是细胞种植的场所和组织再生的模板,引导组织再生和控制组织结构,是组织工程能否应用于临床的关键因素. 本实验我们研究新型骨组织工程TCP/CPPF/PLLA支架的降解性能及生物相容性,为今后进一步利用组织工程修复骨缺损提供实验和理论基础.
实验材料
按支架复合物质量比β?TCP∶CPPF∶PLLA=2∶3∶5,采用溶媒浇注/粒子滤取技术与气体发泡相结合的方法制备新型骨组织工程支架材料β?TCP/CPPF/PLLA,由兰州交通大学复合材料研究室石宗利教授合成.
试验方法
βTCP/CPPF/PLLA(Wt:30/37/33)材料呈白色多孔状,直径11 mm,长15 mm. 液体置换方法测得支架材料密度0.15 g/cm3,孔隙率81.35%,孔径为150~200 μm,压缩模量为(7.2±0.54)MPa. 支架材料的横截面和纵截面的扫描电镜(SEM),可以看出支架材料为高孔隙率的三维网状、连通微孔结构,CPP纤维表面包裹有一层PLLA基体,纤维随机分布,纤维之间由PLLA黏接. β?TCP在横截面及纵截面上分布较均匀. 将试样真空干燥至恒重(W0)后放入盛有人工降解液(Hank?s液,pH=7.4)的试管中(固液比1∶20),在37℃下密闭降解,分别在降解的6,15 wk时将试样取出. 将降解试样干燥处理后,锐刀横切、喷金,用扫描电子显微镜观察.将βTCP/CPPF/PLLA支架材料切割成3 mm×3 mm×5 mm长方形块状物,环氧乙烷熏蒸消毒后保存. 支架材料在使用前无菌条件下用750 mL/L乙醇浸泡6 h,含血清培养基置换4次,每次浸泡20 min,以改善材料的亲水性. 取出材料,用DMEM培养液、含血清DMEM培养液浸泡后,吸干液体待用. 将诱导培养7 d的细胞消化后,经计数(台盼蓝染色细胞活度大于90%)后,调整细胞悬液密度为1×1010/L,接种到处理后的支架中至饱和,置入37℃, 50 mL/L CO2,饱和湿度孵箱内孵育4 h(2 h后翻面)后,小心取出细胞-材料复合体,将其置于10 mL离心管底部,每管加入诱导培养基4 mL,置入37℃, 50 mL/L CO2,饱和湿度孵箱内孵育,每2~3 d换液一次. 体外培养3~5 d后,取出材料细胞复合体,用30 mL/L的戊二醛固定24 h后,液氮冷冻后,断开材料,乙醇系列脱水,自然干燥,表面喷金,扫描电子显微镜观察其表面及内部微观结构.
实验结果
经过6 wk降解,支架仍为三维连通微孔结构,与降解前相比较其微观结构没有明显的变化,但15 wk以后,可以看出CPPF已经大部分降解,材料中间纤维为空洞样,支架还保持三维连通微孔结构。细胞复合物扫描电镜观察培养3~5 d在材料表面有大量细胞贴附生长,呈圆球形,并有不规则突起(图2,3). 断面剖开后观察,见材料内部有大量细胞贴附生长,呈圆球形,细胞被分泌的胶原基质包裹,在微孔壁及边缘密集分布,部分区域细胞堆积