实验概要

    本方法主要介绍小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定流程。

    主要试剂

    高糖DMEM(Gibco,cat NO：12800-017粉末）、DMEM/F12（Gibco,cat NO：12500-062粉末）、胎牛血清（FBS）（Gibco,cat NO：16000044）
非必需氨基酸（NEAA）（Gibco,cat NO：11140050）、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid（Gibco,cat NO：25200072）、明胶（BD,cat NO：354277）、青链霉素（SP）（Gibco,cat NO：15140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO：25030081)、血清替代物（Gibco,cat NO：10829028）
10%FBS培养液(Gibco , cat NO.10099141）

    主要设备

    1、超净台

    2、CO2培养箱(Thermo , cat NO.3131)

    3、6cm培养皿(corning , cat NO.430166)、10cm培养皿(corning , cat NO.430167)

    4、15ml离心管(corning , cat NO.430791)、50ml离心管(corning , cat NO.430829)、冻存管(corning , cat NO.430659)

    5、正置显微镜

    实验步骤

    ①常规方法消化细胞，吹打时用粗口滴管，只吹打成细胞团块；

    ②将细胞团块移至6 cm或10 cm培养皿中，改用含10%FBS的培养液培养（每个6 cm培养皿加5 ml培养液）；

    ③将培养皿放入37℃CO2培养箱培养，每天取出1－2次，轻轻晃动或用粗口滴管吹打，使细胞悬浮，各团分开，并逐日观察；

    ④一般培养第3天细胞团开始分层，外部是一层较大的内胚层样细胞，内部的细胞则小而紧密，为外胚层样细胞和干细胞，此为简单类胚；再培养5－10天，分层增多，并出现空腔，整个胚呈圆泡状，此为囊状胚。

    ⑤收集囊状胚，提取mRNA，反转录为cDNA，然后使用三胚层的引物进行PCR来检测三胚层的基因的表达情况，从而确定囊状胚中是否有三胚层的分化，这样可以确定细胞是否具有在体外分化为三胚层细胞的能力。