能够将缺陷基因的功能性拷贝插入到患者的基因组中，对于许多从事遗传疾病治疗的临床医生来说是一个诱人的目标。现在，斯坦福大学医学院的研究人员设计出了一种新方法来实现这种遗传技能。他们的研究论文“Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”发布在10月29日的《自然》（Nature）杂志上。

    这种方法不同于其他一些广受欢迎的技术，它不需要共传递内切核酸酶在特异位置剪切受体的DNA。它也不依赖于共同插入称作为启动子的遗传“on”开关来激活新基因表达。</p>

    这些差异有可能使得这一新技术更为安全及持久。利用这一技术，斯坦福大学的研究人员通过插入血友病小鼠缺失的一个凝血因子的编码基因治愈了这些动物。

    论文的资深作者、儿科学和遗传学教授Mark Kay博士说：“看起来我们能够实现插入基因的终身表达，这在治疗诸如血友病和重症联合免疫缺陷等遗传病时尤为重要。不需使用启动子或核酸酶我们就能够做到这一点，由此大大降低了新基因自身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。”论文的主要作者是博士后学者Adi Barzel。

    利用这一技术，Kay和同事们将缺失的一个凝血因子的功能性基因拷贝插入到了血友病小鼠的DNA中。尽管只在1%的肝细胞中实现了基因插入，这些细胞生成了足够的缺失凝血因子来改善这一疾病。

    有可能替代CRISPR

    斯坦福大学的这一研究发现有可能给称作为CRISPR/Cas9的基因组技术提供了一种替代选择。CRISPR/Cas9技术依赖于细菌为抵抗病毒攻击所形成的一种古老的保护性反应。就像美洲印第安人在战斗中每杀死一个敌人，便在自己帽子上插一支羽毛作为一种荣誉标志一样，每一次细菌战胜病毒，它都会将入侵物的小部分DNA保留于自身的基因组中。累积的这些病毒区域就叫做成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)区域。当病毒再来之时，细胞便利用保留的遗传物质片段来鉴别并结合到病毒基因组的匹配区域上。一旦附着，它便会利用Cas9蛋白在精确的位点切割病毒基因。</p>

    世界各地的研究人员不仅开始使用这种CRISPR/Cas9技术在实验动物中永久地让研究基因丧失功能，还插入了一些新的修饰基因到动物的基因组中。这使得他们能够快速地构建出遗传改造试验动物；这项在过去要花费数月或数年的工作现在只需数天或数周。

然而，CRISPR/Cas9技术不仅需要编码Cas9核酸酶的基因（其自身就可以整合到受体的基因组中），还需要启动子来驱动基因表达。研究人员担心如果用于人类，Cas9有可能会在意外的位点切割DNA，这会破坏或是杀死细胞。另外，新基因的启动子有可能会对邻近基因的表达造成不利的影响，引起癌症或其他的疾病。外源的细菌蛋白还可引起患者的免疫反应。

    Barzel说：“位点特异性的基因打靶是基因治疗和基因组工程中最快速发展的领域之一。但使用核酸酶和启动子有可能产生显著不利的影响。我想找到一种新的基因打靶方案，其不涉及载体传送启动子，也不需要使用内切核酸酶。”研究人员设计的这一新技术没有使用核酸酶来切割DNA，也不需要启动子来驱动凝血因子基因表达。相反，研究人员将新基因的表达与肝脏中高水平表达的albumin基因联系在了一起。Albumin基因可编码生成血液中最丰富的一种蛋白：白蛋白。它帮助调控了血容量，使得一些不易溶于水的分子能够在血液中传输。

    研究人员利用了基因治疗中常用的一种病毒——腺相关病毒（AAV）的改良版本。在这一改良的病毒载体中，所有的病毒基因被删除，只保留了治疗基因。它们依赖于一种称作为同源重组的生物学现象来将凝血因子基因插入到albumin基因附近。通过在两基因间使用一种特殊的DNA接头（linker），研究人员能够确保凝血因子蛋白的生成与高表达的白蛋白密切关联。</p>

    在同源重组过程中，细胞利用了自身每条染色体具有两个拷贝这一事实。通过将受损和未受损的染色体排列在一起，细胞可以借鉴完整的拷贝来修复受损染色体，因此不会丢失至关重要的遗传信息。Kay和Barzel利用同源重组这一自然过程，将来自病毒载体的序列拷贝到了基因组中研究人员指定的位置——在本例中，是在albumin基因的后面。

    在新生和成体小鼠中都有效

    当他们在新生实验室血友病小鼠中测试他们的方法时发现动物开始表达凝血因子，且表达水平达到了正常水平的7-20%。以往的研究证实这样的凝血因子量在小鼠中具有治疗效应。他们进一步证实，这一技术令人惊奇地也可成体动物中起作用，尽管基因只成功地插入到了不到1%的肝细胞中。

    Kay说：“我们预期这种方法能够在新生动物中起作用，因为它们的肝脏仍然在生长。由于一直以来人们认为同源重组大多发生在增殖细胞中，我们没有料到它也能够在成体动物中起作用。”

    多年来Kay一直致力于血友病的基因治疗。在2006年，他作为一个研究小组的领导者，利用AAV向罹患B型血友病的患者提供了一种凝血因子基因。B型血友病没有A型血友病那样常见，每2.5万名男孩中有一人受累于这一疾病（由于这一疾病是由X染色体上的一个缺陷基因所引起，它很少影响女孩）。然而，由于这一缺失凝血因子的基因较小，更易于基因治疗操作，因此B型血友病更容易靶向治疗。正如许多的病毒一样，AAV也具有不同的病毒株。不幸的是，在2006年的研究中采用的这种AAV病毒株在人体表达凝血因子只维持了数月，不同于在动物体内长期的表达。近期，英国启动了另一项相似的临床试验，利用了一种不同的AAV病毒株，研究人员在患者接受改良病毒后的两年多时间观察到了6名患者体内的凝血因子表达。

    Kay 说：“AAV的真正问题在于，当基因不整合到基因组中去时不清楚其表达将能够维持多久。能够从治疗中最大受益的婴儿和儿童仍然在生长，由于不能在细胞之间拷贝，非整合的基因会失去它的效力。此外，由于患者会对AAV产生免疫反应不太可能再给予这种治疗。而获得整合，我们就可以实现终身表达，且不必担心癌症或其他的DNA损伤。”

    研究人员现正计划在肝脏包含有人类和小鼠细胞的小鼠中测试这一技术，他们近期证实了这种模型可以是进一步预测人体中所发生事件的一个好的替代物。