自从25年前小鼠胚胎干细胞(ESC)的发现以来，研究人员利用它们的特性，已经在核苷酸的精确度上，设计了越来越多复杂的遗传学改变。小鼠ESC因其很快的生长速度、易于转染和克隆，可高度服从于遗传修饰。外源供体载体和内源基因组之间较高的同源重组率，通常可在小鼠ESC中得以实现。多年来，基因打靶载体设计的持续改进，使得研究人员能够设计几乎携带任何所需基因修饰的小鼠。但是，小鼠ESC的卓越性现在正受到CRISPR及相关核酸内切酶Cas的挑战，后者能直接对小鼠胚胎进行遗传工程改造。

　　近年来，CRISPR/Cas9技术飞速发展，使用CRSPR系统将重组Cas9蛋白和合成引导性RNA注入小鼠受精卵，就能很容易的进行基因敲除和敲入。最近在国际著名学术期刊《Genome Biology》发表的一项研究中，来自英国威康基金会桑格研究所的William C Skarnes博士撰写题为“Is mouse embryonic stem cell technology obsolete?”的研究亮点文章指出，这些新技术将很快取代使用胚胎干细胞的基因修饰，小鼠胚胎干细胞技术的终结是不可避免的。

　　小鼠胚胎干细胞技术的一个明显缺点是，从ES细胞产生基因修饰小鼠的时间较长，过程也比较复杂。并不是所有的ES细胞系都是健壮的，ES细胞的基因组不稳定性是生殖系传递失败的原因之一。尽管存在诸多困难，到目前为止科学家已经从ES细胞产生了25,000种转基因小鼠品系。

　　在小鼠ES细胞中进行基因打靶不久之后，研究人员开始质疑，同源重组是否可能存在于1-细胞胚胎中。很显然，同源重组在受精卵中的频率过低，不能提供ES细胞技术的可行替代方案。大约在同一时间，有研究小组在小鼠ES细胞中进行的实验表明，通过诱导靶位点的双链断裂，使用同源供体质粒的基因打靶效率增加了至少50倍。双链断裂不能通过同源重组修复，同源重组修复通常与易出错的非同源末端连接(NHEJ)的小插入或缺失特点相关。这些开创性的实验，为小鼠胚胎基因组编辑奠定了基础，接着，出现了可编程的位点特异性核酸酶，最初使用锌指核酸酶以及最近的CRISPR-Cas9核酸酶。

　　目前，研究人员已经使用CRISPR-Cas9在小鼠受精卵及其他模式物种中，产生基本的等位基因。现在，NHEJ诱导的简单插入/缺失，或通过同源指导修复的单链寡核苷酸引入，通常可通过转基因设备进行。然而，更复杂的等位基因需要与一个供体质粒同源重组，通过受精卵注射更难产生。因为首建动物(Founder animal)通常是嵌合的，靶基因到下一代的传递是没有保证的。因此，要在小鼠ES细胞中进行各种各样可能的遗传修饰，就需要进一步完善Cas9辅助的小鼠受精卵基因打靶。

　　基于Cas9核糖核蛋白(RNP)，有研究小组已经开发出了高效的方法，在小鼠中产生敲入基因。利用Cas9核糖核蛋白有几个优势。首先，看到的同源重组效率增加，部分是由于Cas9蛋白复合物是直接激活的。当用供体质粒传递给细胞核时，Cas9核糖核蛋白可立即促进靶位点的同源重组。其次，胚胎短时间地暴露Cas高活性，降低了嵌合体和脱靶损伤的可能性。

　　核酸酶辅助的基因组编辑的引人瞩目，标志着遗传工程领域的一次革命。特别是，CRISPR-Cas系统使用简单，对胚胎和细胞进行修饰的试剂可以从供应商那里购买到。我们期望这些试剂质量和传递方法可以得到不断的改善。关于Cas内切酶的特异性，科学家对这项技术一直都有担忧，但是随着更多人报道在首建动物中很少或没有脱靶损伤，这些担忧将烟消云散。与在培养的胚胎干细胞中所看到的基因组不稳定性相比，CRISPR-Cas技术相对安全。有研究表明，Cas9辅助的基因打靶在小鼠胚胎中是非常有效的，从而使得研究人员能够对复杂的等位基因进行遗传改造。因此，现在看来，小鼠胚胎干细胞技术的终结是不可避免的。

　　从实用的角度来看，合成引导性RNA使用非常方便，省去了克隆和体外纯化转录单引导性RNA的需要。使用重组Cas9蛋白和合成引导性RNA，研究人员在首建动物中看到了非常高频率的同源重组，这是非常令人鼓舞的。要确定这种方法是否推广到其他位点和其他脊椎动物，还需要更多的研究。