CRISPR/Cas9作为一种基因治疗法，因其能通过DNA剪切技术治疗多种疾病而闻名。CRISPR/Cas9并不是一种十分完善的编辑技术，它也有缺点，例如脱靶现象等，并且在基因组编辑实验中的实验效果也会受到参数与生物学因素的影响。为了更好的完善这项技术，比利时布鲁塞尔自由大学的研究人员在最新一期的《BioTechniques》上提出了优化CRISPR/Cas9实验的指南和工具。下面再生医学网就为您推送这条资讯。
目标位点的选择
研究人员认为，认真确定目标位置是至关重要的。对于许多应用而言，功能丧失（loss-of-function）分析必不可少。常规的策略是利用sgRNA将Cas9核酸酶引导到蛋白质编码基因的N端外显子。在Cas9核酸酶的作用下，通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）来修复双链断裂，从而引入移码突变和提前终止密码子。
CRISPR诱导突变的高效率让基因敲除变得很轻松。然而，在靶向细胞必需的基因时，这却成了一个问题。之前，两项不同的全基因组CRISPR筛选已经确定人类基因组中大约有2000个必需基因。最近，Lenoir等人发布了一个数据库，可以从中搜索到不同人体组织中的必需基因。
因此，在研究功能丧失时，RNAi或CRISPRi已成为有效的替代研究方法，它们的效果可通过转录组水平的分析来直接评估。同时，诱导型的CRISPR工具实现了时间严格控制的基因组编辑。
作者还建议仔细评估目标区域的遗传多态性，因为它可能对CRISPR/Cas9的效果产生相当大的影响。尽管sgRNA与目标序列之间允许存在五个以内的碱基错配，但PAM及其附近序列对序列一致型有着更严格的要求。在选择sgRNA时，应当验证PAM和sgRNA结合位点是否存在SNP，因为这会影响Cas9的结合和切割。
值得注意的是，实验室中常用细胞系的DNA序列可能不完全对应于基因组数据库中的序列。在设计sgRNA之前，对目标位点进行测序可解决这一潜在的问题。细胞系倍性也是需要考虑的因素。许多癌细胞系携带四条或更多的染色体拷贝。完全敲除需要在目标基因的所有拷贝上引入突变。在产生突变克隆细胞系时，强烈建议对目标基因座进行测序，以确认纯合性敲除。
此外，染色质的状态也大大影响Cas9结合和核酸酶活性。核小体的定位直接阻碍Cas9在体内和体外的结合和切割。染色质高级结构也会影响Cas9结合和酶活。一些研究表明Cas9切割效率与开放染色质呈正相关。虽然一些基因编辑应用程序可以选择易于切割的目标，但这种做法显然不适用于基因修复及其他的治疗应用。
模式生物的基因靶向为人们带来了更多的挑战，因为染色质景观在不断变化，以确保早期发育过程中的生长和分化。作者认为，转录组图谱（RNA-Seq）和染色质开放性图谱（ATAC-Seq和ChIP-Seq）是很有用的资源，可以预测sgRNA的效率。全基因组小鼠（Brie）和人类（ Brunello）文库的发表极大地促进了小鼠和人类细胞的基因编辑。
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导入方法
将CRISPR/Cas9组分导入细胞通常是利用DNA导入系统来实现的，比如将编码Cas9和sgRNA的质粒转染到细胞内。病毒颗粒的转导也是一种常用方法，往往比质粒转染更有效，适用于包括原代细胞在内的许多种细胞。
质粒转染和病毒转导分别实现了Cas9的瞬时表达和永久表达。当然，Cas9的长时间表达会导致脱靶事件的积累。因此，人们试图控制Cas9和sgRNA的表达时间，以便降低脱靶效应。研究发现，强力霉素（doxycycline）诱导的启动子可实现Cas9的瞬时表达，并且与慢病毒载体兼容。
若担心质粒整合的问题，可以使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物来实现基因编辑。Cas9 RNP复合物可自行制备，或从各个供应商处购买。RNP复合物的导入方法也有很多种，比如脂质体转染、电穿孔、显微注射等。对于植物细胞而言，用基因枪导入Cas9 RNP复合物或编码Cas9和sgRNA的质粒似乎是一种不错的方法。
研究发现，RNP复合物在导入12至24小时内切割染色体DNA，而基因编辑的频率在1天后到达平台期。若采用质粒来表达Cas9和sgRNA，在导入3天后才能达到相同的基因编辑水平。此外，Cas9蛋白在24至48小时内迅速降解，而质粒可连续表达几天。因此，RNP复合物的使用可减少脱靶效应。
RNP复合物的另一个优点是适用于各种模式生物和细胞类型。研究发现，对体内环境而言，Cas9/sgRNA RNP复合物的功能优于其他导入方法。以斑马鱼研究为例，人们将编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白连同sgRNA一起显微注射到受精胚胎中进行诱变。与编码Cas9的mRNA相比，RNP复合物在显微注射后立即起作用。若是导入mRNA，还要考虑密码子优化的问题。
在利用慢病毒或质粒导入Cas9和sgRNA时，通常利用抗性标记（潮霉素或嘌呤霉素）或报告基因（GFP）来分离成功转导或转染的细胞。在转染RNP复合物时可使用替代报告基因（surrogate reporter）。荧光形式的Cas9（比如Cas9-GFP或Cas9-Cy3）可用来分选RNP转染的细胞。
向导RNA的效率和特异性
对于同一基因而言，不同sgRNA的表现也许千差万别。目前有许多生物信息学工具可用来设计sgRNA，其中一些工具可对sgRNA进行打分。不过，没有一种工具可以保证sgRNA的效果，因此在可能的情况下，尽量测试多个sgRNA，并利用核酸内切酶切割实验来鉴定sgRNA在体外的切割效果。当然，这不能保证体内有效性，因为还取决于染色质开放性。
Cas9的靶向特异性取决于20 nt的sgRNA向导序列以及基因组中与目标序列相邻的PAM的存在。值得注意的是，将sgRNA向导序列缩短至17 nt，可明显提高靶向特异性。许多在线工具可以辅助sgRNA的设计，但预测效果和实际效果往往有很大差异，因为光凭序列同源性不能完全预测脱靶位点。
理论上来说，对编辑前后的细胞进行全基因组测序（WGS）分析可无偏向地检测脱靶。不过，WGS本身也面临挑战，可能不适用于脱靶突变的检测。尽管测序成本不断下降，但人们需要一定程度的生物信息学知识来检测小的插入缺失，并将信号和噪声区分开。此外，克隆扩增期间也可能出现许多自发的新突变，无法与脱靶效应区分。
为了克服这些限制，人们最近开发了几种方法来检测基因组中Cas9的脱靶活性，比如BLESS（标记DSB后富集和测序）、HTGTS（高通量的全基因组易位测序）、GUIDE-Seq（通过测序实现全基因组内DSB的无偏向鉴定）、Digenome-Seq（体外Cas9消化的WGS）、IDLV（利用整合酶缺陷型慢病毒载体检测脱靶）以及最近的SITE-Seq（鉴定DNA切割位点的生化方法）和CIRCLE-Seq（体外鉴定脱靶突变的方法）等。
染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的首选技术。因此，您可以通过ChIP-qPCR来评估dCas9在目标区域的特异性富集，同时还可以将这种方法扩展到ChIP-Seq，实现无偏向的脱靶位点分析。作者认为，基于dCas9的ChIP-PCR/Seq是一种强大的方法，能够快速经济地评估几条sgRNA。不过，没有一种方法能保证完全覆盖脱靶位点，因此理想的方案是结合使用多种方法。
展望未来
若要将Cas9应用于基因治疗，必须要解决几个问题。首先，Cas9核酸酶通常来源于常见的人类病原体。最近的报道称人群对SpCas9和SaCas9已经有免疫力。如何控制Cas9引起的免疫应答，这是一个问题。其次，另一个限制是Cas9比较大，无法包装到腺相关病毒载体中，可以考虑Cas9核酸酶家族的其他成员，比如Cas12a（Cpf1）。此外，Cas13a和CasRx也为基于RNA编辑的新疗法铺平了道路。
