耳聋，无疑是一件极其残酷的事情，让无数患者丧失了聆听世界万千声音的机会。更为残酷的是，许多患者自出生起就丧失了听觉，这一现象又被称之为遗传性耳聋。在过去，临床医学上针对先天性耳聋并无行之有效的治疗方法，这让许多患者不得不抱憾终身。

　　再生医学网获悉，近日，来自北京脑科学与类脑研究中心（CIBR）的熊巍实验室首次在哺乳动物模型上展示了利用非同源末端连接的基因修复通路有效实现先天性遗传疾病的在体基因治疗。相关研究成果发表在Cell子刊Cell Reports上。

　　本研究展示了接收声音振动的听觉毛细胞可以利用内源性DNA修复通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修复InDel导致的移码突变，在遗传性耳聋动物模型（Pcdh15av-3j小鼠，携带一个腺苷的插入突变）上实现了导入单个gRNA有效修复该插入导致的遗传性耳聋，而PCDH15蛋白是毛细胞tip link的组分，是毛细胞机械转导通道开放的关键蛋白，蛋白质量有215kD之巨。该概念的成功验证提示占人类22%的移码突变导致的遗传性疾病有广阔的治疗前景。

　　耳蜗毛细胞的基因递送一直是一个难点，熊巍博士早前开发了一套耳蜗组织培养和基因电转递送的系统解决方案（Xiong et al.,Nat.Protoc.2014），实现在培养的耳蜗组织上通过电转（较大规模）向毛细胞导入外源基因，后续通过电生理或者钙成像研究特定基因干预后的毛细胞功能变化。基于该耳蜗电转技术，熊巍实验室首先扫描了av-3j突变（1bp插入）上下游15bp的区域内的4条gRNA所产生的编辑产物，发现其中的m-3j-gRNA1表现出高比例的1bp删除的编辑产物，而且重复性很高，意味着m-3j-gRNA1是一个潜在的治疗av-3j突变的备选gRNA。在培养的Pcdh15av-3j耳蜗组织上，通过电转表达了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15av-3j毛细胞可以恢复PCDH15蛋白的表达（Pcdh15av-3j突变导致PCDH15不表达上膜），同时Pcdh15av-3j毛细胞的机械转导功能也有所恢复。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在内的回码（frame-restored）产物类别中，其最高占比产物均对PCDH15功能有明显恢复，提示蛋白修复产物在非保守区即使1-2氨基酸的插入或者删除并非绝对无功能，从转化角度考虑也是值得去开发的一种可能性。

　　根据体外研究的效果，熊巍实验室进一步对Pcdh15av-3j小鼠在体耳蜗注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。通过对电转耳蜗组织（体外）和病毒注射耳蜗组织（在体）的基因编辑产物进行的系统比对，发现它们无论是在主编辑产物还是产物的比例上均非常一致。进一步的对m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指标的评估，包括耳蜗毛细胞的PCDH15表达（蛋白表达）、耳蜗毛细胞的机械转导电流（细胞功能）、小鼠的听性脑干电位（ABR，听觉生理）和惊吓反应（Startle，行为学）等，均显示单个m-3j-gRNA1在spCas9的帮助下即可实现av3j突变的功能性恢复。熊巍实验室同时也检验了前庭器官的恢复效果，结果显示Pcdh15av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢复。

　　熊巍实验室在2015年建立实验室之时即确立了研究遗传性耳聋基因治疗的方向，所有的技术和资源都是从零开始积累，期间尝试了多种策略和方法，最终锁定利用到NHEJ的非随机修复机制来重塑移码突变导致的致聋突变。本工作从2019年底投稿到2022年上半年最终接收，历时2年半，不可谓不艰难，不过“凡是过去，皆为序章”！

　　基因编辑作为新兴技术的杰出代表，自问世起就在各行业得到了广泛应用，尤其是在医疗领域，基因编辑技术更是发挥出强大的作用，为各种遗传性疾病的治疗贡献出独特且有效的治疗方案。对此，再生医学网表示，相信在不久的将来，遗传性耳聋或将不再是医学难题