再生医学网小编近日读到一篇不错的关于牙周组织工程新技术的研究进展的好文章。原作者为四川大学华西口腔医院的杨雪婷、杨波、田卫东。特转载如下：
由牙周炎等疾病导致的牙周支持组织丧失可引起牙齿逐渐松动、脱落，进而影响发音和进食，导致一系列生理和心理问题。因此，牙周病治疗的终极目标在于使已经丧失的牙周组织得到再生并形成新附着。目前，植骨术、引导性组织/骨组织再生术（guided tissue/bone regeneration，GTR/GBR）、局部使用生长因子等技术已在临床中用于牙周缺损的治疗并取得一定疗效，但上述方法仍存在一些不足——易形成长结合上皮、再生牙骨质的能力较差、GTR的适应证较窄及膜降解时易塌陷等。组织工程技术作为重建损伤或缺失组织器官的技术，已逐渐成为主流的研究手段，也为牙周组织再生带来新的希望。近年来随着组织工程技术的发展，涌现出一大批新技术、新方法，并在诸多领域取得突破性进展，使实现功能性牙周再生成为可能。现简要介绍近年来牙周组织工程领域取得的新进展及应用较广泛的4种新技术，以期探讨未来牙周再生的发展方向。
一、利用传统构建方式进行的牙周再生研究
将种子细胞与单纯的支架材料复合是牙周组织工程传统的构建方法。牙周组织工程中常见的种子细胞主要包括牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLC）、牙囊细胞、牙髓细胞、骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）等，传统的支架材料则包括β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）、羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/TCP、水凝胶等人工合成的高分子材料及胶原、纤连蛋白、壳聚糖、藻酸盐等天然生物材料。
Mrozik等证实，同种异体的PDLC复合明胶海绵支架可在绵羊牙周缺损区形成新的牙骨质和有序排列的穿通纤维（Sharpey's fiber），说明利用同种异体种子细胞进行牙周再生的策略可行。Lemaitre等发现，用胶原支架接种鼠脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）也可在牙周缺损区形成新的牙骨质和排列整齐的牙周纤维，并有新生血管插入其中，证明ADSC也具有一定的牙周再生能力。在比格犬一壁骨袋牙周炎模型中，Zang等发现壳聚糖/无机牛骨（chitosan/anorganic bovine bone，C/ABB）与BMSC复合可促进骨组织和牙骨质-牙周膜样组织形成。
上述实验结果均表明，利用传统的种子细胞与支架材料复合的组织工程方法进行牙周再生的策略是可行的。但到目前为止，再生组织与天然的牙周组织在结构、纤维排列方向和行使功能等方面仍存在较大差异，如何再生出具有正常结构并能行使功能的牙周组织仍是目前亟待解决的问题。近10年来，伴随着制造业、材料学、分子生物学等领域的飞速发展，越来越多的新技术、新方法被应用于组织工程中，也使牙周组织工程再生进入一个新的时期。
二、牙周组织工程再生中的新方法及新技术
细胞与支架材料是组织工程中占主导地位的两大要素。在细胞培养方面，组织工程领域应用的新技术可包含三维培养技术、细胞膜片技术等，在支架材料的加工方面则主要包括脱细胞技术、静电纺丝技术。近年来新兴的三维打印技术实现了细胞与支架材料之间的精密复合，有望成为实现功能性
牙周组织再生的新技术。
1．细胞膜片技术：
是近年来发展较迅速的组织工程技术之一，它是将种子细胞在特殊诱导培养基的培养下，诱导种子细胞分泌大量的细胞外基质，细胞与细胞之间紧密连接，形成肉眼可见的膜状结构。因细胞膜片技术具有细胞接种率高、分布均匀、操作性好等优点，其在牙周组织工程再生领域中表现出明显的优越性。早在1993年，Okano等就利用温度反应性材料聚N-异丙基丙烯酰胺（poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm）首次制备出细胞膜片。该技术无需酶消化，能将细胞外基质较完整地保存下来，而细胞外基质中的生长因子受体、离子通路等有利于加强细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的连接和信号转导，使其能更好地发挥功能[14]。但上述方法所用到的材料价格昂贵，制取过程复杂，因此一些成本较低且简便易行的方法进而被研究和发明。有研究表明维生素C能促进细胞分泌细胞外基质并形成膜片，还有学者利用温度敏感性水凝胶、聚合电解质、电活性导电聚合物-聚吡咯等方法获取细胞膜片。自2005年起，细胞膜片技术作为新手段开始应用于牙周组织再生并取得一系列可喜成绩Tsumanuma等比较了同种异体及自体来源的PDLC膜片在犬水平型牙周缺损模型中的再生能力，结果显示二者差异无统计学意义，由此可见，利用同种异体的细胞膜片移植进行牙周组织再生也是可选择的策略之一。Wang等[20]利用PDLC膜片、BMSC膜片和富血小板血浆形成的三层结构包裹经处理的牙本质基质/HA/TCP构建生物牙根，在裸鼠体内成功再生出牙周膜样和牙槽骨样组织。Panduwawala等将人PDLC膜片、人脐静脉内皮细胞膜片及包含两种细胞的混合细胞膜片分别包裹支架材料移植到裸鼠皮下，发现各组均有牙周纤维样组织形成，而只有包含HUVEC的组内有新生血管形成。上述两组实验均采用两种种子细胞膜片联合应用的组织工程策略，结果也证实细胞膜片技术在多细胞复合方面同样具有独特的优点。Gao等则验证了利用组织工程方法再生的牙周组织是否能行使正常的牙周功能，他们在HA/TCP支架外部包裹牙髓细胞膜片进行小型猪牙槽窝原位移植并在其上方进行烤瓷冠修复，临床疗效评估表明利用该方法构建的生物牙根与种植体的牙齿功能相比差异无统计学意义，其生物力学性能与天然牙更接近，而种植体的相关指标则显著高于天然牙。
综上所述，细胞膜片技术作为组织工程中细胞移植的一种新型载体，在多细胞复合、提高细胞存活率和可操作性方面均表现出巨大潜力。但在研究中发现其仍存在一些不足之处：膜片的培养周期长、培养成本高；单纯的细胞膜片机械强度欠佳、易收缩变形，故实验中通常将其与其他支架联合应用等。与GTR、GBR等技术相比，细胞膜片技术仍处于临床前研究阶段，相信随着未来技术的不断完善，细胞膜片将凭借其独特的优势成为有望应用于临床的牙周组织工程技术。
是近年来发展较快的组织工程技术，有望为牙周组织再生提供新的研究手段。脱细胞支架材料是将同种异体或异种组织按照一定的方法将细胞成分去除，保留组织的天然三维形态结构及细胞外基质成分，形成无免疫原性或低免疫原性的天然支架材料。在应用中可接种自体干细胞于脱细胞支架材料进行组织再生。此项技术目前已被广泛应用于心脏、角膜、肝脏、肾脏、皮肤等组织的再生，部分研究成果已用于临床疾病的治疗，具有广阔的应用前景。常用的脱细胞方法可分为物理法、化学法及生物法。物理法主要包括冻融法、机械振荡法、电穿孔法等；化学试剂法则包括除垢剂、酸碱溶液、醇类等；而生物制剂包括酶类如DNA酶、RNA酶等以及非酶类试剂如乙二胺四乙酸等。利用脱细胞技术进行牙周组织再生的研究尚处于初级阶段。2014年Farag等利用脱细胞技术成功制备了人脱细胞PDLC膜片并验证了其再细胞化潜能，证明非离子型除垢剂0.5% Triton X-100联合DNA酶具有良好的脱细胞效果。随后该课题组又比较了静态及动态的脱细胞处理方法对PDLC膜片生物学性能的影响，结果显示两者差异无统计学意义。将人脱细胞PDLC膜片移植入鼠牙周缺损模型，4周后未见明显的免疫排斥反应，且可见排列致密、有序的牙周纤维形成并部分插入牙根表面，表明利用异种脱细胞PDLC膜片进行牙周组织再生也是可行的策略之一。学者们在将其他组织器官的脱细胞支架材料用于组织构建过程中发现，相同类别的脱细胞支架是相应组织再生较理想的支架材料。牙周膜有别于其他组织，是位于牙骨质与牙槽骨间厚度仅为0.15~0.38 mm，具有一定排列方向的致密结缔组织。目前仅能通过拔牙及机械刮除的方式获得牙周膜组织，且获得的牙周膜组织较分散，不利于脱细胞处理。因此，寻找对牙周膜组织最适宜的脱细胞处理方法，是目前将脱细胞技术应用于牙周组织工程面临的最大挑战。脱细胞方法的选择将影响处理后组织的生物学特性、力学性能及移植后的宿主反应，因此不同的组织应摸索其最适合的脱细胞方法及处理时间，要求既能达到最佳的脱细胞效果，又能适当保留原有的组织结构。而脱细胞支架移植后的宿主反应强弱主要取决于残余细胞的含量，因此还需制定合理、标准化的脱细胞效果鉴定流程。相信随着对脱细胞技术研究的不断深入，同种异体甚至异种脱细胞支架也能为牙周组织工程技术开辟新的路径。
3．静电纺丝技术：
近10余年来，随着材料学的发展，静电纺丝技术在组织工程领域备受青睐，目前已在骨、血管、皮肤再生等诸多领域取得一定进展。利用该技术可以制备出直径几纳米至几百纳米不等的纤维，纤维之间相互交错形成复杂多孔的网状结构，大大提高表面积，在电镜下观察其超微结构与细胞外基质非常相似，因此更有利于细胞在其表面的黏附、增殖和分化。当纤维的方向呈随机无序排列时，细胞在其表面散乱生长，而定向、有序排列的纤维则可引导细胞沿其纤维排列的长轴生长。目前，已用于静电纺丝的组织工程支架材料可分为天然生物材料和人工合成的高分子材料，其中天然生物材料主要为胶原基质、蚕丝蛋白、壳聚糖、纤连蛋白等；合成材料主要是一些生物可降解材料如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯等。Nivedhitha等证实，由纳米级与微米级聚己内酯混合电纺丝片和加载了硫酸钙的胶原组成的双层支架在体外具有良好的蛋白吸附作用，可诱导细胞向成骨及成纤维方向分化。Chen等利用静电纺丝技术构建纤维定向排列的PLGA/明胶电纺片，发现该支架在小型猪体内可促进新生的有细胞牙骨质和定向排列的牙周纤维形成，说明PLGA/明胶电纺丝支架具有良好的理化特性及生物相容性，是牙周组织工程中较理想的支架材料。静电纺丝材料凭借可控的生物降解速率、良好的生物相容性及可引导细胞沿纤维走向定向生长的特点，在牙周组织工程领域表现出巨大的优势。然而，由于纤维之间的孔隙大小不一，一些纳米级孔隙使细胞无法进入而只能在纤维表面生长，因此近年来的研究目标已从二维的平面支架向三维的空间支架方向转换。Jiang等将聚己内酯-聚乙二醇静电纺丝片嵌入多孔的壳聚糖中形成具有一定厚度的三维支架结构，结果显示细胞可以渗透进材料内部约40 μm；在鼠牙周炎模型中该支架可诱导形成骨组织、牙骨质样组织及成熟、排列整齐的胶原纤维，且部分纤维垂直插入到新形成的牙骨质中。目前研究显示，利用静电纺丝技术制备的纤维定向支架材料具有良好的理化特性及细胞引导作用，适合牙囊细胞等种子细胞的生长，是牙周组织工程中较理想的支架材料；但其在应用过程中仍有一定的缺陷和不足，在未来的研究中，如何控制其降解速率使其与牙周组织的再生速度匹配，如何调整材料的孔隙率和制作更加满足需求的三维支架使细胞能在材料内部更好地生长和分化等，都是利用静电纺丝技术进行牙周再生亟需解决的问题。相信随着材料和改良方式的不断尝试和进步，静电纺丝技术的优越性和多样性可为牙周组织再生提供更适合的支架材料。
4．三维打印技术：
三维打印是20世纪80年代产生和发展起来的一种新技术，其最早应用于制造业。三维打印是通过在平面上逐层增加材料形成具有三维立体结构的实体。近年来三维打印已进入一个新的发展时期，生物打印技术应运而生。所谓生物打印是指在保证细胞活性的前提下，将种子细胞、生长因子及适宜的支架材料通过三维打印的方法制作成有活性、复杂的三维立体组织，如三维打印的心肌组织、心脏瓣膜及血管等。相较于静电纺丝法、冻干法等其他组织工程构建方法，三维打印技术可通过计算机进行辅助设计和制作，具有精度及仿真度高、个性化按需打印、制作效率高、耗时短等优点[38,39,40]。因上述特点，三维打印技术在复杂的牙周组织再生领域表现出显著的优越性。2012年Park等利用计算机辅助设计-三维打印技术打印出与小鼠牙周缺损区域形状相似的纤维定向聚己内酯仿生三维引导支架，复合骨形成蛋白7及PDLC进行缺损区的移植，结果显示形成了与天然牙周纤维排列相似的牙周膜样组织。同年Vaquette等[42]利用熔融沉积成形技术打印出TCP/聚己内酯支架模拟骨组织，与包裹PDLC膜片的聚己内酯静电纺片及牙本质块共同移植到裸鼠皮下，结果表明有新生的牙骨质、牙周膜样组织形成，但裸鼠皮下与牙周的微环境仍存在差异，再生的纤维大多与牙本质块表面平行排列，距功能性牙周再生仍有一定差距。2016年Pilipchuk等对Park设计的三维支架进行改进，构建了带有超微结构的聚己内酯立体支架，并在牙本质片表面观察到牙骨质-牙周膜样组织形成，但新生的骨组织全部包绕在支架外部，未形成完整的牙骨质-牙周膜-牙槽骨的"三明治"样结构。尽管三维打印技术在牙周组织再生的临床前实验中取得了一定进展，但目前研究仅限于利用该技术打印出支架材料后再接种细胞进行移植，而利用基于干细胞的三维生物打印技术构建牙周组织尚罕见报道。2015年，意大利学者Rasperini等利用三维打印技术为临床1例牙周缺损患者进行支架的个性化设计，并将打印的支架移植到患者牙周缺损区域。但术后第13个月移植的支架材料出现暴露，经修剪暴露的支架材料及全身抗炎治疗后伤口持续开裂，不得不将支架材料取出，最终导致治疗失败。由此可见，三维打印技术尚处于起步阶段，目前还存在不少技术难题亟待解决。首先，目前已报道的文献中利用该项技术构建的支架材料即使有微米级的超微结构，但支架的整体大小仍为毫米甚至厘米级别，与天然牙周组织150~380 μm的大小相去甚远。其次，牙周组织是结构和功能极其复杂的软硬组织复合体，穿通纤维自牙槽嵴顶至根尖区的每个截面与牙骨质形成的夹角均不完全相同，若能利用三维打印高精度的特点模拟出类似的结构，距离打印功能性的牙周组织将更近一步。
目前三维打印技术在我国口腔领域的应用主要集中在口腔颌面部骨缺损的修复、计算机辅助设计与辅助制作全瓷冠及个性化舌侧正畸托槽等方面，尚无应用三维打印技术进行牙周组织再生的相关报道，希望未来国内能有更多的科研团队对其进行深入研究。
三、问题与展望
综上所述，构建功能性的牙周组织已成为当今国内和国际牙周再生领域的重要发展方向。牙周组织的功能重建是一个复杂的过程，既要求新生的骨、牙骨质及牙周纤维具有正常的排列结构，又要求这三者间能相互作用并协同发挥功能，而利用牙周组织工程技术进行牙周缺损修复及再生研究则呈现出巨大的潜力。但在牙周组织再生中，仍存在一系列亟待解决的问题，如用于牙周再生的成体干细胞来源常涉及伦理问题、支架材料的降解速率与牙周组织的再生速率不匹配等。上述问题的解决，需要材料学、分子生物学、药学等多学科、跨专业联合发展。相信在各专业领域研究者的共同努力下，未来可以真正再生出具有正常结构并能行使功能的牙周组织。
（备注：图片源于网络。）
